Introduksjon

En av livets karakteristiske manifestasjoner er evnen til levende organismer til kinetisk regulere kjemiske reaksjoner, og undertrykke ønsket om å oppnå termodynamisk likevekt. Enzymkinetikk studerer mønstrene for påvirkning av den kjemiske naturen til reagerende stoffer (enzymer, substrater) og betingelsene for deres interaksjon (konsentrasjon, pH, temperatur, tilstedeværelse av aktivatorer eller inhibitorer) på hastigheten til enzymatiske reaksjoner. Hovedmålet med å studere kinetikken til enzymatiske reaksjoner er å få informasjon som kan bidra til å belyse den molekylære mekanismen for enzymvirkning.

Avhengighet av hastigheten på enzymatisk reaksjon på substratkonsentrasjon

enzymsubstrat biokjemisk hemmer

De generelle prinsippene for kjemisk reaksjonskinetikk gjelder også for enzymatiske reaksjoner. Det er kjent at evt kjemisk reaksjon karakterisert ved en termodynamisk likevektskonstant. Det uttrykker tilstanden til kjemisk likevekt oppnådd av systemet og er betegnet med Kr. Så for reaksjonen:

likevektskonstanten er lik produktet av konsentrasjonene av de resulterende stoffene delt på produktet av konsentrasjonen av utgangsstoffene. Verdien av likevektskonstanten finner man vanligvis fra forholdet mellom hastighetskonstantene til forover (k+1) og revers (k-1) reaksjoner, dvs.

Ved likevekt er hastigheten på fremreaksjonen:

v+1 = k+1[A]*[B]

lik hastigheten på omvendt reaksjon:

v-1 = k-1[C]*[D],

de. v+1 = v-1

følgelig k+1[A]*[B] = k-1[C]*[D],

Ris. 1.

reaksjoner fra substratkonsentrasjon ved konstant konsentrasjon

enzym

a - første ordens reaksjon (ved [S]<Кm скорость реакции пропорциональна концентрации субстрата); б - реакция смешанного порядка; в - реакция нулевого порядка, когда v = Vmaxi скорость реакции не зависит от концентрации субстрата.

Dermed er likevektskonstanten lik forholdet mellom hastighetskonstantene for forover- og bakreaksjonene. Den resiproke av likevektskonstanten kalles vanligvis substratkonstanten, eller, i tilfelle av en enzymatisk reaksjon, dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset, og er betegnet med symbolet KS. Ja, som reaksjon

de. KS er lik forholdet mellom produktet av konsentrasjonen av enzymet og substratet og konsentrasjonen av enzym-substratkomplekset eller forholdet mellom hastighetskonstantene for revers og fremoverreaksjoner. Det skal bemerkes at KS-konstanten avhenger av den kjemiske naturen til substratet og enzymet og bestemmer graden av deres affinitet. Jo lavere KS-verdi, desto høyere affinitet har enzymet til substratet.

Når man studerer kinetikken til enzymatiske reaksjoner, bør en viktig egenskap ved disse reaksjonene (ikke karakteristisk for vanlige kjemiske reaksjoner) tas i betraktning, assosiert med fenomenet metning av enzymet med substratet. Ved lave substratkonsentrasjoner er reaksjonshastighetens avhengighet av substratkonsentrasjonen (fig. 1) nesten lineær og følger førsteordens kinetikk. Dette betyr at reaksjonshastigheten S -> P er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av substratet S og til enhver tid bestemmes t av følgende kinetiske ligning:

hvor [S] er den molare konsentrasjonen av substratet S; -d[S]/dt - substrattaphastighet; k" er reaksjonshastighetskonstanten, som i dette tilfellet har en dimensjon som er resiprok til tidsenheten (min-1 eller s-1).

Ved høye substratkonsentrasjoner er reaksjonshastigheten maksimal, blir konstant og uavhengig av substratkonsentrasjonen [S]. I dette tilfellet følger reaksjonen nullordens kinetikk v = k" (med fullstendig metning av enzymet med substratet) og bestemmes helt av konsentrasjonen av enzymet. I tillegg er det andreordens reaksjoner, hastigheten på som er proporsjonal med produktet av konsentrasjonene av de to reagerende stoffene. Under visse forhold, når proporsjonaliteten brytes, sier de noen ganger om reaksjoner av blandet orden (se fig. 1).

Mens de studerte fenomenet metning, utviklet L. Michaelis og M. Menten en generell teori om enzymatisk kinetikk. De gikk ut fra antagelsen om at den enzymatiske prosessen fortsetter i form av følgende kjemiske reaksjon:

de. enzym E interagerer med substrat S for å danne et mellomkompleks ES, som videre spaltes til et fritt enzym og reaksjonsprodukt P. Matematisk prosessering basert på massevirkningsloven gjorde det mulig å utlede en ligning, oppkalt etter forfatterne av Michaelis- Menten-ligning, som uttrykker det kvantitative forholdet mellom substratkonsentrasjon og enzymatisk reaksjonshastighet:

hvor v er den observerte reaksjonshastigheten ved en gitt substratkonsentrasjon [S]; KS er dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset, mol/l; Vmax er maksimal reaksjonshastighet når enzymet er fullstendig mettet med substratet.

Av Michaelis-Menten-ligningen følger det at ved høy substratkonsentrasjon og lav KS-verdi er reaksjonshastigheten maksimal, d.v.s. v=Vmax (nullordensreaksjon, se fig. 1). Ved lave substratkonsentrasjoner, tvert imot, er reaksjonshastigheten proporsjonal med substratkonsentrasjonen til enhver tid (førsteordens reaksjon). Det skal påpekes at Michaelis-Menten-ligningen i sin klassiske form ikke tar hensyn til påvirkningen av reaksjonsprodukter på hastigheten til den enzymatiske prosessen, for eksempel i reaksjonen

og har på seg flere begrenset karakter. Derfor ble det forsøkt å forbedre den. Dermed ble Briggs-Haldane-ligningen foreslått:

hvor Km representerer Michaelis-konstanten, som er en eksperimentelt bestemt størrelse. Det kan representeres med følgende ligning:

Ris. 2. - Michaelis-Menten ligningskurve: hyperbolsk

avhengighet av starthastighetene til den enzymkatalyserte reaksjonen

på substratkonsentrasjon

Telleren representerer hastighetskonstantene for dekomponeringen av ES-komplekset i to retninger (mot den innledende E og S og mot de endelige reaksjonsproduktene E og P). Forholdet k-1/k+1 representerer dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset KS, da:

En viktig konsekvens følger av dette: Michaelis-konstanten er alltid større enn dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset KS med mengden k+2/k+1.

For å bestemme den numeriske verdien av Km, finner man vanligvis konsentrasjonen av substratet der hastigheten på den enzymatiske reaksjonen V er halvparten av maksimal Vmax, dvs. hvis V = 1/2 Vmaks. Ved å erstatte verdien av V i Briggs-Haldane-ligningen, får vi:

dividere begge sider av ligningen med Vmax, får vi

Dermed er Michaelis-konstanten numerisk lik substratkonsentrasjonen (mol/l) hvor hastigheten på en gitt enzymatisk reaksjon er halvparten av maksimum.

Å bestemme Km-verdien er viktig for å belyse virkningsmekanismen til effektorer på enzymaktivitet, etc. Michaelis-konstanten kan beregnes fra grafen (fig. 2). Segmentet på abscissen som tilsvarer en hastighet lik halvparten av maksimum vil representere Km.

Det er upraktisk å bruke en graf konstruert i direkte koordinater for avhengigheten av den initiale reaksjonshastigheten v0 av den initiale substratkonsentrasjonen, siden maksimalhastigheten Vmax i dette tilfellet er en asymptotisk verdi og ikke er bestemt nøyaktig nok.

Ris. 3.

For en mer praktisk grafisk presentasjon av eksperimentelle data, transformerte G. Lineweaver og D. Burke Briggs-Haldane-ligningen ved å bruke metoden for doble resiprokale basert på prinsippet om at hvis det er likhet mellom to størrelser, vil de resiproke også være like. . Spesielt hvis

så etter transformasjon får vi ligningen:

som kalles Lineweaver-Burk-ligningen. Dette er ligningen for en rett linje:

Hvis vi nå, i samsvar med denne ligningen, konstruerer en graf i koordinatene 1/v(y) fra l/[S](x), vil vi få en rett linje (fig. 3), tangensen til helningsvinkelen hvorav vil være lik verdien av Km/Vmax; segmentet avskåret av en rett linje fra ordinataksen er l/Vmax (det resiproke av maksimalhastigheten).

Hvis vi fortsetter den rette linjen utover ordinataksen, så kuttes et segment av på abscissen som tilsvarer den resiproke verdien av Michaelis-konstanten - 1/Km (se fig. 3). Dermed kan verdien av Km beregnes fra dataene på helningen til den rette linjen og lengden på segmentet avskåret fra ordinataksen, eller fra lengden på segmentet avskåret fra abscisseaksen i området negativ verdier.

Det bør understrekes at verdiene til Vmax, så vel som verdien av Km, kan bestemmes mer nøyaktig enn fra en graf konstruert i direkte koordinater fra en graf konstruert ved hjelp av den doble gjensidige metoden. Derfor har denne metoden funnet bred anvendelse i moderne enzymologi. Lignende grafiske metoder er også foreslått for å bestemme Km og Vmax i koordinatene for avhengigheten av v på v/[S] og [S]/v av [S].

Det bør bemerkes at det er noen begrensninger i bruken av Michaelis-Menten-ligningen på grunn av de mange formene for enzymer og enzymets allosteriske natur. I dette tilfellet, en graf over avhengigheten av den innledende reaksjonshastigheten på substratkonsentrasjonen (kinetisk

Ris. 4.

kurve) har ikke en hyperbolsk form, men en sigmoid karakter (fig. 4) som ligner på hemoglobin oksygenmetningskurven. Dette betyr at bindingen av ett substratmolekyl på ett katalytisk sted øker bindingen av substratet til et annet sted, dvs. en samarbeidende interaksjon finner sted, som i tilfellet med oksygen som forbinder de 4 underenhetene av hemoglobin. For å estimere substratkonsentrasjonen der reaksjonshastigheten er halvparten av maksimum, under forhold med den kinetiske kurvens sigmoide natur, brukes vanligvis den transformerte Hill-ligningen:

hvor K" er assosiasjonskonstanten; n er antall substratbindingssentre.

Kinetikken til enzymatiske reaksjoner er diskutert i verkene til Menten og Michaelis. Forskere beskrev dette problemet i detalj i ligningen av enzym-substratkomplekset.

Definisjon

Funksjoner ved kinetikken til enzymatiske reaksjoner vurderes i vitenskapen om enzymer, som studerer avhengigheten av hastigheten til en slik prosess på de kjemiske egenskapene til underlaget, miljøet og fremmede faktorer som påvirker forløpet av den kjemiske reaksjonen.

Med en betydelig konsentrasjon av underlaget vil det ikke påvirke hastigheten på prosessen.

Spesifikasjoner for kurset

Analyse av enzymaktivitet utføres ved betydelige konsentrasjoner av substrater (null orden av den kjemiske prosessen). Under slike forhold vil bare mengden enzym påvirke endringen i prosessens hastighet.

Kinetikken til enzymatiske reaksjoner i levende celler har noen særegne egenskaper. Enzymene i dem blir ikke brukt til sitt fulle potensial. Hvis det er en overflødig mengde substrat, som er mulig under eksperimentelle forhold, vil reaksjonshastigheten være proporsjonal med mengden enzym. Med en betydelig økning i denne indikatoren observeres et brudd på slik proporsjonalitet.

Virkning av modulatorer på enzymer

Kinetikken til enzymatiske reaksjoner forklarer den lineære økningen i prosessens hastighet med økende substratinnhold. Med en overdreven økning i konsentrasjonen observeres en reduksjon i substratet, og hastigheten på den kjemiske prosessen avtar.

Kinetikken til enzymatiske reaksjoner bekrefter enzymaktivitetens avhengighet av pH i miljøet, spesifisiteten til enzymet og dets mengde. Stoffer som påvirker forløpet av en slik reaksjon kalles modulatorer eller effektorer. De er vanligvis delt inn i inhibitorer og aktivatorer, som hjelper til med å bremse eller akselerere en viss prosess.

Det grunnleggende om kinetikken til enzymatiske reaksjoner gjør det mulig å fullt ut forstå essensen av effektene av disse stoffene. Noen av dem regnes som naturlige regulatorer av den metabolske prosessen. Spise forskjellige typer modulatorer av enzymaktivitet, som skiller seg fra hverandre i deres virkningsmekanisme og struktur.

Aktivatoralternativer

Hva kjennetegner kinetikken til enzymatiske reaksjoner? Biokjemi anser gallesyrer, metallioner og anioner som aktivatorer. Det er situasjoner hvor ett stoff i forhold til ett enzym vil fungere som en aktivator, men ellers vil det virke som en inhibitor. Metallioner er spesifikke aktivatorer for å identifisere enzymer.

De kan stimulere prosessen med å feste et substrat til enzymet, delta i dannelsen av dets tertiære struktur, eller kan fungere som en del av det aktive senteret.

Hva er kinetikken til enzymatiske reaksjoner? Kort fortalt kan det bemerkes at kationer av mange metaller er essensielle komponenter som er nødvendige for full funksjon av mange enzymer. Noen av dem krever flere forskjellige ioner samtidig. For eksempel krever ATPase, som transporterer ioner over plasmamembranen, magnesium-, natrium- og kaliumioner.

Metaller kan finnes i protesegruppen av enzymer. For eksempel regnes jern som en viktig komponent av katalase i porfyrinforbindelser. Kobolt er tilstede i protesegruppen av metylmalonylisomerase og homocysteintransmetylase, og mangan er nødvendig for aktivering av isocitratdehydrogenase. Det er en gruppe enzymer som aktiveres av cAMP. Slike enzymer kalles proteinkinaser. Den består av to underenheter:

• katalytisk, som inneholder det aktive senteret;
• regulatorisk, hvor cAMP-bindingssenteret er lokalisert.

Bare med samspillet mellom reguleringssenteret til enzymet og c-AMP får det aktivitet.

Kinetikk av enzymatiske reaksjoner: Michaelis konstant, tilstander for forekomst, alt dette er diskutert i detalj i fysisk kjemi.

Funksjoner av enzymer

De er kompakte molekyler, har en relativ molekylvekt på 104 og en diameter på 20A. Enzymer som er en del av kuleproteiner dannes ved en viss kobling av 20 aminosyrerester ved peptidbindinger.

Den indre strukturen til enzymer i biokjemi er preget av fire typer strukturer:

• primær er assosiert med den genetiske koden;
• sekundær struktur karakteriserer spiraliseringen av kjeden;
• tertiær bestemmer det romlige arrangementet av helixen til polypeptidkjeden;
• kvartær er assosiert med assosiasjonen av kuler til et aktivt oligomert enzym.

Spesifikasjoner for prosesser med ett substrat

Den enzymatiske reaksjonskinetikken til Michaelis-Menten-ligningen forklarer forholdet mellom hastighet og substratkonsentrasjoner.

I 1903 innrømmet L. Henri at enzymet danner en slags mellomforbindelse med substratet. Hvis selve enzymet regnes som E, substratet S, vil mellomproduktet ha formen ES.
For å analysere kinetikken til denne prosessen tok L. Michaelis en mekanisme som inkluderer to stadier: reversibel og irreversibel.

De kinetiske ligningene til disse to prosessene har en ganske kompleks form. For å løse dem brukes stasjonære konsentrasjoner. Produksjonshastigheten til en mellomprodukt er beskrevet av massevirkningsloven, som relaterer de innledende konsentrasjonene av substratet og enzymet, strømindikatorer, samt konsentrasjonene av mellomstoffet og reaksjonsproduktet.

Funksjoner ved løsningen

Hva er den grunnleggende kinetikken til enzymatiske reaksjoner? Tabellen som brukes i fysisk kjemi lar deg løse et ligningssystem i følgende tilfeller:

• når konsentrasjonen av utgangsstoffer synker;
• når mengden av produkt overstiger mengden av mellomkomplekset.

For enzymatiske prosesser er et hastighetsforhold tilfredsstilt der den andre konstanten betydelig overstiger verdien til den første. Årsaken er ustabiliteten til den mellomliggende forbindelsen og dens ubetydelige konsentrasjon.

I følge IUPAC-beslutningen ble konstanten som lar oss beskrive kinetikken til en kjemisk prosess kalt Michaelis-konstanten.

Den lineære avhengigheten av starthastigheten på substratkonsentrasjonen ble eksperimentelt bekreftet.

Fysisk betydning av Michaelis-konstanten

For å svare på dette spørsmålet tas substratkonsentrasjonen der enzymet viser halvparten av sin aktivitet. Michaelis-konstanten har samme dimensjon som startkonsentrasjonen av substratet: mol/l.

De numeriske parameterne til denne konstantverdien varierer fra 10 -2-10-8 M. Under eksperimentelle studier ble det funnet at Michaelis-konstanten er en funksjon av temperaturen. Det avhenger av tilstedeværelsen av andre stoffer som fungerer som en aktivator eller inhibitor i prosessen.

Spesielt tilfelle

Hvis det i løpet av prosessen oppnås en tilstand der likhet av konstanter observeres, etableres likevekt i systemet. Dette gjør det mulig å bruke tilnærmingen av kvasi-likevektskonsentrasjoner under analysen av enzymatiske prosesser.

Som et resultat er uttrykket for Michaelis-konstanten betydelig forenklet; det karakteriserer affiniteten til enzymet for substratet som brukes.

Hemming av enzymatiske prosesser

Slike stoffer er reagenser som, når de introduseres i reaksjonssystemet, reduserer interaksjonshastigheten betydelig. Enzymatisk katalyse krever foreløpig adsorpsjon av substratet, dets klare orientering i forhold til de aktive gruppene i det katalytiske senteret, og inhibering kan bare begrenses til den vanlige bindingen av inhibitoren til noen fragmenter av adsorpsjonsstedet.

Forbindelser kan utvise hemmende egenskaper på grunn av dannelsen av sterke komplekser (cyanider), så vel som når de virker på karbonylgruppen med denaturering av proteiner.

Typer hemming

Effekten av å bremse kjemisk interaksjon observeres av flere grunner:

• Inhibitoren konkurrerer om det aktive stedet med substratet, og skaper et inaktivt sted med enzymet. Hvis konsentrasjonen av substratet øker, gjenopprettes aktiviteten i løsningen av selve enzymet.
• Inhibitoren fester seg til en annen del av proteinmolekylet, og danner dermed et inaktivt kompleks. Enzymet gjenoppretter sin opprinnelige aktivitet under påvirkning av andre stoffer uten å påvirke underlaget.

Prosessens hastighet er relatert til dannelseshastigheten til sluttproduktet gjennom konsentrasjoner, Michaelis-konstanten. Sistnevnte verdi kan bestemmes grafisk og også uttrykkes matematisk fra en formel. Når komplekset er inaktivt, forstyrrer ikke inhibitoren reaksjonen mellom enzymet og substratet, men reduserer prosessens hastighet betydelig.

Ved statistisk behandling av eksperimentelle data var det mulig å identifisere hovedparametrene for ikke-konkurrerende hemming og bevise sammenhengen mellom hastighets- og konsentrasjonsindikatorene.

Kinetikken til kjemiske prosesser innebærer å beskrive egenskapene til alle stadier ved å bruke konstante verdier, Michaelis-Menten-ligningen. Eksperimentelle studier avslørte en sammenheng mellom hastigheten på den enzymatiske prosessen og endringer i konsentrasjonen av reaksjonsproduktet eller det opprinnelige substratet.

I tillegg er det etablert en sammenheng mellom hastighet og enzymets natur. Det er på dens egenskaper at aktivitet og atferdsegenskaper under interaksjon direkte avhenger. Målingen av enzymaktivitet er én standardenhet, som karakteriserer mengden enzym som katalyserer omdannelsen av µmol av det opprinnelige substratet per minutt.

Enzymer er mye brukt i moderne medisin; hastigheten på å identifisere problemet, samt kvaliteten på å stille en medisinsk diagnose for pasienten, avhenger direkte av deres aktivitet.

Enzymkinetikk studerer påvirkningen av ulike faktorer (S- og E-konsentrasjoner, pH, temperatur, trykk, inhibitorer og aktivatorer) på hastigheten til enzymatiske reaksjoner. Hovedmålet med å studere kinetikken til enzymatiske reaksjoner er å få informasjon som tillater en dypere forståelse av enzymers virkningsmekanisme.

Kinetisk kurve lar deg bestemme den innledende reaksjonshastigheten V 0 .

Substratmetningskurve.

Avhengighet av reaksjonshastighet på enzymkonsentrasjon.

Avhengighet av reaksjonshastighet på temperatur.

Avhengighet av reaksjonshastighet på pH.

Den optimale pH for virkningen av de fleste enzymer ligger innenfor det fysiologiske området 6,0-8,0. Pepsin er aktivt ved pH 1,5-2,0, som tilsvarer surheten til magesaften. Arginase, et leverspesifikt enzym, er aktivt ved 10,0. Påvirkningen av pH på hastigheten til en enzymatisk reaksjon er assosiert med tilstanden og graden av ionisering av ionogene grupper i enzym- og substratmolekylene. Denne faktoren bestemmer konformasjonen av proteinet, tilstanden til det aktive senteret og substratet, dannelsen av enzym-substratkomplekset og selve katalyseprosessen.

Matematisk beskrivelse av substratmetningskurven, Michaelis konstant .

Ligningen som beskriver substratmetningskurven ble foreslått av Michaelis og Menton og bærer navnene deres (Michaelis-Menten-ligningen): V = (V MAKS *[ S])/(Km+[ S]) , hvor Km er Michaelis-konstanten. Det er lett å regne ut at når V = V MAX /2 Km = [S], dvs. Km er substratkonsentrasjonen der reaksjonshastigheten er ½ V MAX. For å forenkle bestemmelsen av V MAX og Km, kan Michaelis-Menten-ligningen beregnes på nytt. 1/V = (Km+[S])/(V MAKS *[S]), 1/V = Km/(V MAKS *[S]) + 1/V MAKS ,

1/ V = Km/ V MAKS *1/[ S] + 1/ V MAKS Lineweaver-Burk-ligning. Ligningen som beskriver Lineweaver-Burk plottet er ligningen til en rett linje (y = mx + c), der 1/V MAX er skjæringspunktet til den rette linjen på y-aksen; Km/V MAX - tangens til den rette linjen; skjæringen av den rette linjen med abscisseaksen gir verdien 1/Km. Lineweaver-Burk-plottet lar deg bestemme Km fra et relativt lite antall punkter. Denne grafen brukes også ved vurdering av effekten av inhibitorer, som vil bli diskutert nedenfor. Km-verdien varierer mye: fra 10 -6 mol/l for svært aktive enzymer, til 10 -2 for lavaktive enzymer.

Km anslag har praktisk verdi. Ved substratkonsentrasjoner som er 100 ganger større enn Km, vil enzymet operere med nær maksimal hastighet, så maksimalhastigheten V MAX vil reflektere mengden aktivt enzym som er tilstede. Denne omstendigheten brukes til å estimere enzyminnholdet i preparatet. I tillegg er Km et kjennetegn på et enzym som brukes til å diagnostisere enzymopatier.

Hemming av enzymaktivitet.

Et ekstremt karakteristisk og viktig trekk ved enzymer er deres inaktivering under påvirkning av visse inhibitorer.

Inhibitorer - dette er stoffer som forårsaker delvis eller fullstendig hemming av reaksjoner katalysert av enzymer.

Hemming av enzymatisk aktivitet kan være irreversibel eller reversibel, konkurrerende eller ikke-konkurrerende.

Irreversibel hemming - dette er vedvarende inaktivering av enzymet, som er et resultat av kovalent binding av et inhibitormolekyl i det aktive stedet eller i et annet spesielt senter som endrer konformasjonen av enzymet. Dissosiasjonen av slike stabile komplekser med regenerering av det frie enzymet er praktisk talt utelukket. For å overvinne konsekvensene av en slik hemming, må kroppen syntetisere nye enzymmolekyler.

Reversibel hemming - karakterisert ved likevektskompleksering av inhibitoren med enzymet på grunn av ikke-kovalente bindinger, som et resultat av at slike komplekser er i stand til å dissosiere med gjenoppretting av enzymaktivitet.

Klassifiseringen av inhibitorer i konkurrerende og ikke-konkurrerende er basert på om den er svekket ( konkurransehemming ) eller ikke svekket ( ikke-konkurrerende hemming ) deres hemmende effekt når substratkonsentrasjonen øker.

Konkurransedyktige hemmere - dette er som regel forbindelser hvis struktur er lik strukturen til underlaget. Dette gjør at de kan binde seg på det samme aktive stedet som substratene, og hindrer enzymet i å interagere med substratet allerede på bindingsstadiet. Etter binding kan inhibitoren omdannes til et produkt eller forbli på det aktive stedet inntil dissosiasjon skjer.

Reversibel konkurransehemming kan representeres som et diagram:

E↔ E-I → E + P 1

S (inaktiv)

Graden av enzyminhibering bestemmes av forholdet mellom substrat- og enzymkonsentrasjoner.

Et klassisk eksempel på denne typen hemming er hemming av succinatdehydrogenase (SDH) aktivitet av malat, som fortrenger succinat fra substratstedet og forhindrer dets omdannelse til fumarat:

Kovalent binding av inhibitoren til det aktive stedet resulterer i inaktivering av enzymet (irreversibel hemming). Eksempel irreversibel konkurransehemming kan tjene som inaktivering av triosefosfatisomerase med 3-kloracetolfosfat. Denne inhibitoren er en strukturell analog av substratet, dihydroksyacetonfosfat, og binder seg irreversibelt til glutaminsyreresten på det aktive stedet:

Noen hemmere virker mindre selektivt, og interagerer med en spesifikk funksjonell gruppe på det aktive stedet til forskjellige enzymer. Bindingen av jodacetat eller dets amid til SH-gruppen av aminosyren cystein, som ligger i det aktive sentrum av enzymet og som deltar i katalyse, fører til et fullstendig tap av enzymaktivitet:

R-SH + JCH2COOH → HJ + R-S-CH2COOH

Derfor inaktiverer disse hemmere alle enzymer som har SH-grupper involvert i katalyse.

Irreversibel hemming av hydrolaser under påvirkning av nervegasser (sarin, soman) skyldes deres kovalente binding til serinresten i det aktive senteret.

Den konkurrerende inhiberingsmetoden har funnet bred anvendelse i medisinsk praksis. Sulfonamidmedisiner, p-aminobenzosyreantagonister, kan tjene som et eksempel på metaboliserte konkurrerende hemmere. De binder seg til dihydropteratsyntetase, et bakteriell enzym som omdanner p-aminobenzoat til folsyre, nødvendig for bakterievekst. Bakterien dør som følge av at det bundne sulfanilamidet omdannes til en annen forbindelse og at det ikke dannes folsyre.

Ikke-konkurrerende hemmere binder seg vanligvis til enzymmolekylet på et annet sted enn substratbindingsstedet, og substratet konkurrerer ikke direkte med inhibitoren. Siden inhibitoren og substratet binder seg til forskjellige sentre, er dannelsen av både E-I-komplekset og S-E-I-komplekset mulig. S-E-I-komplekset brytes også ned for å danne et produkt, men med en lavere hastighet enn E-S, så reaksjonen vil bremse ned, men ikke stoppe. Følgende parallelle reaksjoner kan derfor oppstå:

E↔ E-I ↔ S-E-I → E-I + P

Reversibel ikke-konkurrerende hemming er relativt sjelden.

Ikke-konkurrerende hemmere kalles allosterisk i motsetning til konkurrerende ( isosterisk ).

Reversibel hemming kan studeres kvantitativt ved å bruke Michaelis-Menten-ligningen.

Med konkurrerende hemming forblir V MAX konstant og Km øker.

Med ikke-konkurrerende hemming reduseres V MAX mens Km forblir uendret.

Hvis et reaksjonsprodukt hemmer enzymet som katalyserer dannelsen, kalles denne hemningsmetoden retroinhibering eller tilbakemeldingshemming . For eksempel hemmer glukose glukose-6-fosfatase, som katalyserer hydrolysen av glukose-6-fosfat.

Den biologiske betydningen av denne hemmingen er reguleringen av visse metabolske veier (se neste leksjon).

PRAKTISK DEL

Oppgave for studenter

1. Studer denaturering av proteiner under påvirkning av løsninger av mineralske og organiske syrer og ved oppvarming.

2. Påvis koenzym NAD i gjær.

3. Bestem amylaseaktivitet i urin (blodserum).

9. STANDARDER FOR SVAR PÅ PROBLEMER, testspørsmål som brukes til å kontrollere kunnskap i klassen (kan brukes som vedlegg)

10. ART OG OMFANG AV MULIG UTDANNINGS- OG FORSKNINGSARBEID PÅ EMNET

(Angi spesifikt arten og formen til UIRS: utarbeide abstrakte presentasjoner, utføre uavhengig forskning, simuleringsspill, fullføre en medisinsk historie ved å bruke monografisk litteratur og andre former)

KURSARBEID

Kinetikk av enzymatiske reaksjoner

Introduksjon

Grunnlaget for livsaktiviteten til enhver organisme er kjemiske prosesser. Nesten alle reaksjoner i en levende organisme skjer med deltakelse av naturlige biokatalysatorer - enzymer.

Berzelius i 1835 var den første som antydet at reaksjonene til en levende organisme utføres takket være en ny kraft, som han kalte "katalytisk". Han underbygget denne ideen hovedsakelig ved eksperimentell observasjon: diastase fra poteter hydrolyserer stivelse raskere enn svovelsyre. Allerede i 1878 kalte Kuhne et stoff som har katalytisk kraft i en levende organisme for et enzym.

Kinetikken til enzymvirkning er en gren av enzymologi som studerer avhengigheten av reaksjonshastigheten katalysert av enzymer på den kjemiske naturen og betingelsene for interaksjon av substratet med enzymet, så vel som av miljøfaktorer. Med andre ord lar enzymkinetikk oss forstå arten av de molekylære virkningsmekanismene til faktorer som påvirker hastigheten på enzymatisk katalyse. Denne delen ble dannet i skjæringspunktet mellom vitenskaper som biokjemi, fysikk og matematikk. Det tidligste forsøket på å beskrive enzymatiske reaksjoner matematisk ble gjort av Duclos i 1898.

Faktisk er denne delen om studiet av enzymer veldig viktig i vår tid, nemlig for praktisk medisin. Det gir farmakologer et verktøy for målrettede endringer i cellemetabolismen, et stort antall legemidler og forskjellige giftstoffer - dette er enzymhemmere.

Hensikten med dette arbeidet er å vurdere reaksjonshastighetens avhengighet av ulike faktorer, hvordan reaksjonshastigheten kan kontrolleres og hvordan den kan bestemmes.

1. Michaelis-Menten kinetikk

Foreløpige eksperimenter som studerer kinetikken til enzymatiske reaksjoner har vist at reaksjonshastigheten, i motsetning til teoretiske forventninger, ikke er avhengig av konsentrasjonen av enzymet (E) og substratet (S) på samme måte som i tilfellet med en konvensjonell sekundær- ordrereaksjon.

Brown og, uavhengig av ham, antok Henri først dannelsen av et enzym-substratkompleks under reaksjonen. Denne antakelsen ble deretter bekreftet av tre eksperimentelle fakta:

a) papain dannet en uløselig forbindelse med fibrin (Wurtz, 1880);

b) invertasesubstratet sukrose kunne beskytte enzymet mot termisk denaturering (O" Sullivan og Thompson, 1890);

c) enzymer ble vist å være stereokjemisk spesifikke katalysatorer (Fisher, 1898-1899).

De introduserte begrepet maksimal hastighet og viste det metningskurve(dvs. reaksjonshastighetens avhengighet av substratkonsentrasjonen) er en likesidet hyperbel. De beviste at den maksimale observerte hastigheten er en av asymptotene til kurven, og segmentet avskåret på abscisseaksen (i området for dens negative verdier) av den andre asymptoten, dvs. konstant i hastighetsligningen, lik i absolutt verdi med substratkonsentrasjonen som kreves for å oppnå halvparten av maksimal hastighet.

Michaelis og Menten foreslo at reaksjonshastigheten bestemmes av desintegrasjonen av ES-komplekset, dvs. konstant k 2 . Dette er bare mulig hvis k 2 - den minste av hastighetskonstantene. I dette tilfellet etableres likevekten mellom enzym-substratkomplekset, det frie enzymet og substratet raskt sammenlignet med reaksjonshastigheten (raskt etablert likevekt).

Den innledende reaksjonshastigheten kan uttrykkes med følgende formel:

v = k 2

Siden dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset er lik

K S = [E] [S] / = k -1 /k 1

da kan konsentrasjonen av fritt enzym uttrykkes som

[E] =K S / [S]

Den totale enzymkonsentrasjonen i reaksjonsblandingen bestemmes av formelen

[E] t = [E] + [ES] = K S [ES] / [S] + [ES]

Reaksjonen når maksimal hastighet når substratkonsentrasjonen er høy nok til at alle enzymmolekyler er tilstede i form av et ES-kompleks (uendelig stort overskudd av substrat). Forholdet mellom starthastigheten og den teoretisk mulige maksimale hastigheten er lik forholdet mellom [ES] og [E] t:

v / V maks = / [E] t = / (K S / [S] + ) = 1 / (K S + [S] +1)

Dette er den klassiske ligningen Michaelis Og Menten, som siden publiseringen i 1913 ble det grunnleggende prinsippet for alle enzymkinetiske studier i flere tiår, og med noen begrensninger forblir det den dag i dag.

Det ble senere vist at den opprinnelige Michaelis-Menten-ligningen hadde flere begrensninger. Det er rettferdig, dvs. beskriver korrekt kinetikken til en reaksjon katalysert av et gitt enzym bare hvis alle følgende restriktive betingelser er oppfylt:

) et kinetisk stabilt enzym-substratkompleks dannes;

) konstant K S er dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset: dette gjelder bare hvis ;

) substratkonsentrasjonen endres ikke under reaksjonen, dvs. konsentrasjonen av det frie substratet er lik dets opprinnelige konsentrasjon;

) reaksjonsproduktet spaltes raskt fra enzymet, dvs. ingen kinetisk signifikant mengde ES-kompleks dannes;

) det andre trinnet av reaksjonen er irreversibelt; mer presist tar vi bare hensyn til starthastigheten, når den omvendte reaksjonen (på grunn av det faktiske fraværet av produkt) fortsatt kan neglisjeres;

) bare ett substratmolekyl binder seg til hvert aktivt sete av enzymet;

) for alle reaktanter kan deres konsentrasjoner brukes i stedet for aktiviteter.

Michaelis-Menten-ligningen tjener som utgangspunkt for enhver kvantitativ beskrivelse av enzymvirkning. Det bør understrekes at den kinetiske oppførselen til de fleste enzymer er mye mer kompleks enn den som antydes av det idealiserte skjemaet som ligger til grunn for Michaelis-Menten-ligningen. Utledningen av denne ligningen antar at det bare er ett enzym-substratkompleks. I mellomtiden, i virkeligheten, i de fleste enzymatiske reaksjoner, dannes minst to eller tre slike komplekser, som forekommer i en viss sekvens.

Her betegner EZ komplekset som tilsvarer den sanne overgangstilstanden, og EP betegner komplekset mellom enzymet og reaksjonsproduktet. Det kan også påpekes at i de fleste enzymatiske reaksjoner er mer enn ett substrat involvert og hhv. større antall Produkter. I reaksjonen med to substrater, S 1 og S 2, kan det dannes tre enzym-substratkomplekser, nemlig ES 1, ES 2 og ES 1 S 2. Hvis reaksjonen gir to produkter, P 1 og P 2, kan det være minst tre til ekstra kompleks EP 1, EP 2 og EP 1 P 2. I slike reaksjoner er det mange mellomstadier, som hver er preget av sin egen hastighetskonstant. Kinetisk analyse av enzymatiske reaksjoner som involverer to eller flere reaktanter er ofte ekstremt kompleks og krever bruk av elektroniske datamaskiner. Men når man analyserer kinetikken til alle enzymatiske reaksjoner, er utgangspunktet alltid Michaelis-Menten-ligningen diskutert ovenfor.

1.1 Konstantens naturKi ligningen

likning enzymatisk reaksjonskinetikk

Det andre postulatet sier at konstanten K S i ligningen er dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset.

Briggs og Haldane beviste i 1925 at den opprinnelige Michaelis-Menten-ligningen bare gjelder for , dvs. når likevekten til elementærtrinnet E+S ES etableres veldig raskt sammenlignet med hastigheten til neste trinn. Derfor sies slike kinetiske mekanismer (underlagt den innledende Michaelis-Menten-tilstanden og har ett sakte elementært stadium, i forhold til hvilket likevekter i alle andre elementære stadier etableres raskt) å tilfredsstille antagelsen om "rask likevekt". Hvis imidlertid k 2 er sammenlignbar i størrelsesorden med k -1 , Endringen i konsentrasjonen av enzym-substratkomplekset over tid kan uttrykkes ved følgende differensialligning:

d / dt = k 1 [E] [S] - k -1 - k 2

Siden vi vurderer den innledende reaksjonshastigheten, dvs. øyeblikk når den omvendte reaksjonen ennå ikke har funnet sted, og det prestasjonære stadiet allerede har passert, er mengden av det dannede enzym-substratkomplekset lik mengden av det desintegrerte på grunn av et overskudd av substrat. ( stasjonaritetsprinsippet, eller Briggs og Haldane kinetikk, eller Bodenstein-prinsippet i kjemisk kinetikk), og det er sant at

d/dt=0

Ved å erstatte dette med differensialligningen får vi et uttrykk for konsentrasjonen av fritt enzym:

[E] = (k -1 + k 2) / k 1 [S]

[E] T = [E] + = [(k -1 + k 2) / k -1 [S] + 1] =

= (k -1 + k 2 + k -1 [S]) / k 1 [S]

Steady state ligning:

K 1 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S])

Fordi v = k 2, så får vi det

v = k 1 k 2 [S] [E] T / (k -1 + k 2 + k 1 [S]) = k 2 [S] [E] T / [(k -1 + k 2) / k 1 + [S]]

I dette tilfellet

V maks = k 2 [E] T

og er lik maksimal hastighet oppnådd fra Michaelis-Menten-ligningen. Konstanten i nevneren til Michaelis-Menten-ligningen er imidlertid ikke K S , de. ikke dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset, men den såkalte Michaelis konstant:

K m = (k -1 + k 2) / k 1

K m er lik K S bare hvis .

I tilfelle av en konstant i nevneren av hastighetslikningen uttrykkes ved formelen

K k = k 2 / k 1

og heter, ifølge Van Slyke, kinetisk konstant.

Steady state-ligningen kan også hentes fra differensialligningen uten å anta at d / dt = 0. Hvis vi erstatter verdien [E] = [E] T - inn i differensialligningen, får vi etter transformasjoner

= (k 1 [S] [E] T - d / dt) / (k 1 [S] + k -1 + k 2)

For å få den stasjonære tilstandsligningen fra denne ligningen, er det ikke nødvendig at d / dt = 0. Det er tilstrekkelig at ulikheten d / dt er tilfredsstilt<< k 1 [S] [E] T . Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Den differensierte steady state-ligningen er som følger:

d / dt = T / (k 1 [S] + k -1 + k 2) 2 ] (d [S] / dt)

Dette uttrykket er åpenbart ikke lik 0.

1.2 Transformasjon av Michaelis-Menten-ligningen

Den opprinnelige Michaelis-Menten-ligningen er en hyperbelligning, hvor en av konstantene (V max) er asymptoten til kurven. En annen konstant (K m), hvis negative verdi bestemmes av den andre asymptoten, er lik substratkonsentrasjonen som kreves for å oppnå V max / 2. Dette er lett å verifisere, siden hvis

v=V maks / 2, da

V maks / 2 = V maks [S] / (K m + [S])

V maks / V maks = 1 = 2 [S] / (K m + [S]) m + [S] = 2 [S], dvs. [S] = K m ved v = V maks /2.

Michaelis-Menten-ligningen kan transformeres algebraisk til andre former som er mer praktiske for grafisk representasjon av eksperimentelle data. En av de vanligste transformasjonene kommer ganske enkelt ned på å likestille de gjensidige til venstre og høyre side av ligningen med hverandre

Som et resultat av transformasjonen får vi uttrykket

som kalles Lineweaver-Burk-ligninger. I følge denne ligningen er grafen plottet i koordinatene 1/[S] og 1/v en rett linje, hvis helning er lik K m /V maks, og segmentet avskåret på ordinataksen er lik 1 /V maks. En slik graf, konstruert ved hjelp av den doble resiproke metoden, har den fordelen at den gjør det mulig å bestemme Vmaks mer nøyaktig; på en kurve plottet i koordinatene [S] og v, er Vmax en asymptotisk verdi og bestemmes mye mindre nøyaktig. Segmentet avskåret på x-aksen på Lineweaver-Burk-grafen er lik -1/K m. Verdifull informasjon om enzymhemming kan også hentes fra denne grafen.

En annen transformasjon av Michaelis-Menten-ligningen er at begge sider av Lineweaver-Burk-ligningen multipliseres med V max *v og etter noen ekstra transformasjoner får vi

Den tilsvarende grafen i koordinater v og v/[S] representerer med e 4, fig. 1]. En slik tidsplan ( Edie-Hofstee diagram) gjør det ikke bare mulig å svært enkelt bestemme verdiene til V max og K m , men gjør det også mulig å identifisere mulige avvik fra linearitet som ikke oppdages på Lineweaver-Burk-plotten.

Ligningen kan også lineariseres i en annen form

[S] / v = K m / V maks + [S] / V maks

I dette tilfellet bør avhengigheten av [S] / v på [S] plottes. Helningen til den resulterende rette linjen er 1/V maks; segmentene avskåret på ordinat- og abscisseaksene er lik henholdsvis (K m / V max) og (- K m). Denne grafen kalles etter forfatterens navn. Haynes diagram.

Statistisk analyse viste at Edie-Hofstee- og Haynes-metodene gir mer nøyaktige resultater enn Lineweaver-Burk-metoden. Grunnen til dette er at i Edie-Hofstee og Haynes grafer er både avhengige og uavhengige variabler inkludert i mengdene plottet på begge koordinataksene.

1.3 Effekt av substratkonsentrasjon på reaksjonskinetikk

I mange tilfeller er betingelsen om konstant substratkonsentrasjon ikke oppfylt. På den ene siden brukes ikke overflødig substrat i in vitro-reaksjoner med enkelte enzymer på grunn av den ofte forekommende hemmingen av substratets enzymatiske aktivitet. I dette tilfellet kan bare dens optimale konsentrasjon brukes, og dette gir ikke alltid det overskytende substratet som er nødvendig for å oppfylle de kinetiske ligningene til mekanismene diskutert ovenfor. Dessuten, i en celle in vivo, oppnås vanligvis ikke overskuddssubstratet som kreves for å oppnå denne tilstanden.

I enzymatiske reaksjoner, der substratet ikke er i overskudd og derfor konsentrasjonen endres under reaksjonen, er dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset lik

K S = ([S] 0 - - [P]) [E] T - )/

([S] 0 - substratkonsentrasjon ved t = 0). I dette tilfellet bestemmes den innledende reaksjonshastigheten (i jevn tilstand) av formelen

v= V maks / (K m + )

hvor er konsentrasjonen av substratet om gangen.

Det er imidlertid mulig å skrive en omtrentlig løsning for to tilfeller når [S] o = :

) hvis denne ulikheten holder på grunn av store verdier av t, dvs. når mer enn 5 % av den opprinnelige substratkonsentrasjonen forbrukes under reaksjonen;

) hvis enzymkonsentrasjonen ikke kan neglisjeres sammenlignet med substratkonsentrasjonen og dermed konsentrasjonen av enzym-substratkomplekset må tas i betraktning.

Hvis t er stor og konsentrasjonen er ubetydelig sammenlignet med [S]0, blir ligningen for dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset følgende:

K S = ([S] 0 - [P]) ([E] T - ) /

For konsentrasjonsverdien som endres under reaksjonen, er en tilfredsstillende tilnærming verdien ([S] 0 + )/2. Siden = [S] 0 - [P], gjennomsnittlig hastighet; kan uttrykkes som

Bytter dette uttrykket og den omtrentlige verdien inn i

v= V maks / (K m + ),

vi får:

Når man sammenligner verdiene beregnet fra denne tilnærmingen med verdiene oppnådd fra den eksakte, integrerte Michaelis-Menten-ligningen, viser det seg at feilen i bestemmelsen av K m er 1 og 4 % ved forbruk av henholdsvis 30 og 50 % av underlaget. Følgelig er feilen i denne tilnærmingen ubetydelig sammenlignet med målefeilen.

Når substratforbruket ikke overstiger 5 % av den opprinnelige konsentrasjonen, men enzymkonsentrasjonen er så høy at sammenlignet med [S] 0 ikke kan ignoreres, er dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset lik:

K s = ([S] 0 - ) ([E] T - ) /

Løsningen hans gir relativt sett

Av de to mulige løsningene kan kun den negative velges, siden bare den tilfredsstiller startbetingelsene: = 0 med [S] 0 = 0 eller [E] T = 0. Analogt med ligningen for forholdet v/V maks, fikk vi ligningen for starthastigheten. Den kvadratiske ligningen oppnådd fra ligningen for dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset, funnet like ovenfor, ved å bruke formlene v = k 2 og V max = k 2 [E] T, kan reduseres til følgende form:

[S] 0 V maks / v = K s V maks / (V maks - v) + [E] T

Det er to begrensende tilfeller å vurdere. I det første tilfellet [S]<

v = (V maks / K m) [S] = k[S]

Dermed har vi fått en tilsynelatende førsteordens reaksjon og k=V max /K m - en tilsynelatende førsteordens kinetisk konstant. Dens faktiske dimensjon er tid -1, men det er en kombinasjon av første og andre ordens hastighetskonstanter av flere elementære stadier, dvs. k 1 k 2 [E] T /(k -1 + k 2) . Under tilsynelatende første ordens forhold k er et mål på reaksjonens fremdrift.

Et annet ekstremtilfelle: [S] >> Km. Her er konstanten K m er neglisjerbar sammenlignet med [S], og dermed får vi v = V maks.

1.4 Dannelse av et kinetisk stabilt enzym-produktkompleks

Hvis det under en reaksjon dannes et kinetisk stabilt enzym-produktkompleks, er reaksjonsmekanismen som følger:

Ved å bruke steady state-antakelsen kan vi skrive differensialligningene:

d /dt = k 1 [E] [S] + k -2 - (k -1 + k 2) = 0 /dt = k 2 - (k -2 + k 3) = 0

Av disse ligningene følger det at

= [(k -2 + k 3) / k 2 ]

[E] = [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S]]

Siden v = k 3

og [E] T = [E] + + =

= [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 k 2 [S] + (k -2 + k 3) / k 2 + 1] =

= ( (k -2 + k 3) + k 1 k 2 [S]] / k 1 k 2 [S])

vi får

K 1 k 2 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2)]= k 1 k 2 k 3 [S] [E] T / (k -2 + k 3 + k 2) ] =

= [E] T [S] / [(k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2) + [S]]

Det er

V maks = [E] Tm = (k -1 k -2 + k -1 k -3 + k 2 k 3) / k 1 (k -2 + k 3 + k 2)

I dette tilfellet er det allerede veldig vanskelig å beregne de spesifikke verdiene til de individuelle hastighetskonstantene, siden bare forholdet deres kan måles direkte. Situasjonen blir enda mer komplisert når mekanismen for en enzymatisk reaksjon blir mer kompleks, når mer enn to komplekser er involvert i reaksjonen, fordi antallet hastighetskonstanter i ligningen er naturlig mye større, og deres relasjoner er også mer komplekse.

Situasjonen er imidlertid forenklet hvis, etter den reversible reaksjonen av dannelsen av det første komplekset, påfølgende elementære stadier er irreversible. Viktige representanter for enzymer som adlyder denne mekanismen er proteolytiske enzymer og esteraser. Mekanismen for reaksjonen deres kan skrives som følger:

hvor ES` er et acyl-enzym-mellomprodukt som brytes ned når det utsettes for vann. Vi kan skrive

V maks = k 2 k 3 [E] 0 / (k 2 + k 3) = k kat [E] 0m = k 3 (k -1 + k 2) / (k 2 + k 3) k 1 kat / K m = k 2 k 1 / (k -1 + k 2) = k 2 / K m '

Michaelis-konstanten for acyleringstrinnet er K m " K s. Jo høyere forhold k cat /K m, jo ​​høyere spesifisitet til substratet.

Bestemmelsen av konstantene blir sterkt forenklet hvis eksperimentet utføres i nærvær av et nukleofilt middel (N) som kan konkurrere med vann. Deretter

k 3 = k 3 ’ og Pi (i = 1, 2, 3) er produkter.

v i = k katt, i [S] / (K m + [S]) katt, 1 = k 2 (k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) katt, 2 = k 2 k 3 / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) katt, 3 = k 2 k 4 [N] / (k 2 + k 3 + k 4 [N]) m = K s ( k 3 + k 4 [N]) / (k 2 + k 3 + k 4 [N])

/v N = K s (k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3 [S] + (k 2 + k 3 + k 4 [N]) / k 2 k 3

Siden det er kjent at K s / k 2 = K m / k katt, og hvis det ikke er noen nukleofil, så

1/v = K s / k 2 [S] + (k 2 + k 3) / k 2 k 3

og for å bestemme konstantene kan du bruke skjæringspunktet til linjene i koordinatene 1/v N (og 1/v) - 1/[S]. To rette linjer i doble inverse koordinater krysser hverandre i andre kvadrant. I fravær av en nukleofil er skjæringspunktet for den rette linjen med den vertikale aksen definert som 1/V max og 1/k cat, og med den horisontale aksen - som -1/K m. Koordinater til skjæringspunktet mellom to linjer: -1/K s og 1/k 3. Avstanden mellom 1/V maks og 1/k 3 er 1/k 2 .

1.5 Analyse av den fullstendige reaksjonskinetiske kurven

Michaelis-Menten-ligningen i sin opprinnelige form gjelder kun for irreversible reaksjoner, dvs. til reaksjoner der kun den initiale hastigheten vurderes, og den omvendte reaksjonen ikke oppstår på grunn av en utilstrekkelig mengde produkt og ikke påvirker reaksjonshastigheten. Ved en irreversibel reaksjon kan den komplette kinetiske kurven enkelt analyseres (for et vilkårlig tidsintervall t ), integrering av den originale Michaelis-Menten-ligningen. I dette tilfellet forblir derfor antakelsen om at kun ett mellomliggende enzym-substratkompleks dannes under reaksjonen. Siden for tidsintervallet t ingen restriksjoner er plassert; konsentrasjonen av substratet på analysetidspunktet kan ikke være lik den opprinnelig introduserte konsentrasjonen. Dermed må også endringen i [S] under reaksjonen tas i betraktning. La S 0 være den opprinnelige konsentrasjonen av substratet, (S 0 - y ) - konsentrasjon på tidspunkt t . Deretter, basert på den originale Michaelis - Menten-ligningen (hvis y - mengde konvertert substrat), kan vi skrive

dy / dt = V maks (S 0 - y) / (K m + S 0 - y)

Ved å ta de resiproke og dele variablene, integrerer vi over y fra 0 til y (V max er utpekt som V):

(2.303 / t) log = V / K m - (1 / K m) (y / t)

Etter å ha plottet avhengigheten til venstre side av ligningen av y/t (Foster-Niemann-koordinater) , vi får en rett linje med en helning (-1/K m) , kutte av segmentet på ordinataksen (V/K m) , og på x-aksen er segmentet V. Integralligningen kan også lineariseres på en annen måte:

t / 2,3031 lg = y / 2,303 V lg + K m / V

eller t/y = 2,3031 K m lg / V y +1/V

Hvis vi studerer en reversibel reaksjon, må vi ta hensyn til hvilket tidsintervall vi har å gjøre med. I det øyeblikket enzymet blandes med substratet, begynner den såkalte prestasjonære fasen, som varer i flere mikro- eller millisekunder, hvorunder enzym-substratkomplekser som tilsvarer den stasjonære tilstanden dannes. Når man studerer reversible reaksjoner over ganske lange tidsperioder, spiller ikke denne fasen noen vesentlig rolle, siden reaksjonen i denne fasen ikke går med full hastighet i noen retning.

For en reaksjon som går fra venstre til høyre, når enzym-substratkompleksene som deltar i reaksjonen den hastighetsbegrensende konsentrasjonen først ved slutten av den prestasjonære fasen. Kvasistasjonær tilstand, der konsentrasjonene av hastighetsbestemmende enzym-substratkomplekser nærmer seg de maksimale konsentrasjonsverdiene i steady state, varer flere tideler av et sekund eller et sekund. I løpet av denne fasen er hastigheten for produktdannelse (eller substratforbruk) nesten lineær i tid. Teoretisk sett har dannelsen av produktet ennå ikke funnet sted, men i praksis er konsentrasjonen så lav at hastigheten på den omvendte reaksjonen ikke påvirker hastigheten på foroverreaksjonen. Denne lineære fasen kalles den innledende reaksjonshastigheten, og så langt har vi bare tatt den i betraktning.

Reaksjonen fra høyre til venstre i neste fase akselererer også på grunn av den gradvise økningen i produktkonsentrasjon (overgangsfase; linearitet i tid observert så langt forsvinner). Denne fasen fortsetter til reaksjonshastigheten fra venstre til høyre blir lik reaksjonshastigheten fra høyre til venstre. Dette er en stat dynamisk balanse, siden reaksjonen fortsetter kontinuerlig i begge retninger med samme hastighet.

2. Faktorer som hastigheten på enzymatisk reaksjon avhenger av

.1 Avhengighet av hastigheten til enzymatisk reaksjon på temperaturen

Når temperaturen i miljøet øker, øker hastigheten på den enzymatiske reaksjonen, når et maksimum ved en eller annen optimal temperatur, og faller deretter til null. For kjemiske reaksjoner er det en regel om at når temperaturen øker med 10°C, øker reaksjonshastigheten to til tre ganger. For enzymatiske reaksjoner er denne temperaturkoeffisienten lavere: for hver 10°C øker reaksjonshastigheten med 2 ganger eller enda mindre. Den påfølgende reduksjonen i reaksjonshastigheten til null indikerer denaturering av enzymblokken. De optimale temperaturverdiene for de fleste enzymer er i området 20 - 40 0C. Termolabiliteten til enzymer er assosiert med deres proteinstruktur. Noen enzymer denatureres allerede ved en temperatur på ca 40 0 ​​C, men hoveddelen av dem inaktiveres ved temperaturer over 40 - 50 0 C. Noen enzymer inaktiveres av kulde, dvs. ved temperaturer nær 0°C oppstår denaturering.

En økning i kroppstemperatur (feber) akselererer biokjemiske reaksjoner katalysert av enzymer. Det er lett å beregne at hver grad økning i kroppstemperatur øker reaksjonshastigheten med ca. 20 %. Ved høye temperaturer på ca. 39-40°C må den sløsede bruken av endogene substrater i cellene til en syk organisme fylles på med mat. I tillegg, ved en temperatur på ca. 40°C, kan noen svært termolabile enzymer denatureres, noe som forstyrrer det naturlige forløpet til biokjemiske prosesser.

Lav temperatur forårsaker reversibel inaktivering av enzymer på grunn av en liten endring i dens romlige struktur, men tilstrekkelig til å forstyrre den passende konfigurasjonen av det aktive senteret og substratmolekylene.

2.2 Reaksjonshastighetens avhengighet av pH i mediet

De fleste enzymer har en spesifikk pH-verdi der deres aktivitet er størst; Over og under denne pH-verdien avtar aktiviteten til disse enzymene. Imidlertid er ikke i alle tilfeller kurvene som beskriver enzymaktivitetens avhengighet av pH klokkeformede; noen ganger kan denne avhengigheten også uttrykkes direkte. Avhengigheten av hastigheten på en enzymatisk reaksjon på pH indikerer hovedsakelig tilstanden til de funksjonelle gruppene til det aktive senteret av enzymet. En endring i pH i mediet påvirker ioniseringen av sure og basiske grupper av aminosyrerester i det aktive senteret, som er involvert enten i bindingen av substratet (i kontaktstedet) eller i dets transformasjon (i det katalytiske stedet). ). Derfor kan den spesifikke effekten av pH være forårsaket enten av en endring i affiniteten til substratet for enzymet, eller av en endring i den katalytiske aktiviteten til enzymet, eller begge årsaker sammen.

De fleste underlag har sure eller basiske grupper, så pH påvirker graden av ionisering av underlaget. Enzymet binder seg fortrinnsvis til enten den ioniserte eller ikke-ioniserte formen av substratet. Ved optimal pH er åpenbart de funksjonelle gruppene til det aktive setet i den mest reaktive tilstanden, og substratet er i en form foretrukket for binding av disse enzymgruppene.

Når du konstruerer kurver som beskriver avhengigheten av enzymaktivitet på pH, utføres målinger ved alle pH-verdier vanligvis under forhold med metning av enzymet med substratet, siden K m-verdien for mange enzymer endres med endringer i pH.

Kurven som karakteriserer enzymaktivitetens avhengighet av pH kan ha en spesielt enkel form i tilfeller der enzymet virker på elektrostatisk nøytrale substrater eller substrater hvor ladede grupper ikke spiller en vesentlig rolle i den katalytiske handlingen. Et eksempel på slike enzymer er papain, samt invertase, som katalyserer hydrolysen av nøytrale sukrosemolekyler og opprettholder konstant aktivitet i pH-området 3,0-7,5.

pH-verdien som tilsvarer maksimal enzymaktivitet, faller ikke nødvendigvis sammen med pH-verdien som er karakteristisk for det normale intracellulære miljøet til dette enzymet; sistnevnte kan være både over og under pH-optimum. Dette antyder at effekten av pH på enzymaktivitet kan være en av faktorene som er ansvarlige for å regulere enzymatisk aktivitet i cellen. Siden cellen inneholder hundrevis av enzymer, og hver av dem reagerer forskjellig på endringer i pH, er pH-verdien i cellen kanskje et av de viktige elementene i det komplekse systemet for regulering av cellulær metabolisme.

2.3 Bestemmelse av enzymmengde ved dets aktivitet

) den generelle støkiometrien til den katalyserte reaksjonen;

) mulig behov for kofaktorer - metallioner eller koenzymer;

) avhengighet av enzymaktivitet på substrat- og kofaktorkonsentrasjoner, dvs. K m-verdier for både substrat og kofaktor;

) pH-verdi som tilsvarer maksimal enzymaktivitet;

) temperaturområde der enzymet er stabilt og beholder høy aktivitet.

I tillegg er det nødvendig å ha en ganske enkel analytisk teknikk til rådighet som lar deg bestemme hastigheten på forsvinningen av substratet eller hastigheten på utseendet til reaksjonsprodukter.

Når det er mulig, utføres enzymanalyser under standardbetingelser som opprettholder optimal pH og substratkonsentrasjoner over metningskonsentrasjonen; i dette tilfellet tilsvarer starthastigheten en null-ordens reaksjon med hensyn til substratet og er kun proporsjonal med konsentrasjonen av enzymet. For enzymer som krever kofaktorer - metallioner eller koenzymer, må konsentrasjonen av disse kofaktorene også overstige metningskonsentrasjonen, slik at enzymkonsentrasjonen er den hastighetsbegrensende faktoren for reaksjonen. Vanligvis kan måling av hastigheten på produktdannelse gjøres med større nøyaktighet enn å måle hastigheten på substratets forsvinning, siden substratet typisk må være tilstede i relativt høye konsentrasjoner for å opprettholde nullordens kinetikk. Dannelseshastigheten til reaksjonsproduktet (eller produktene) kan måles ved kjemiske eller fotometriske metoder. Den andre metoden er mer praktisk, siden den lar deg kontinuerlig registrere fremdriften av reaksjonen på opptakeren.

I henhold til internasjonal avtale antas en enhet for enzymatisk aktivitet å være mengden enzym som er i stand til å forårsake omdannelse av ett mikromol substrat per minutt ved 25°C under optimale forhold. Spesifikk aktivitet enzym er antall enheter av enzymatisk aktivitet per 1 mg protein. Denne verdien brukes som et kriterium for renheten til enzympreparatet; det øker når enzymet renses og når sin maksimale verdi for et ideelt rent preparat. Under antall omdreininger forstå antall substratmolekyler som gjennomgår konvertering per tidsenhet per enzymmolekyl (eller per aktivt senter) under forhold der reaksjonshastigheten er begrenset av enzymkonsentrasjonen.

2.4 Enzymaktivering

Regulering av enzymer kan utføres gjennom interaksjon med dem av forskjellige biologiske komponenter eller fremmede forbindelser (for eksempel medikamenter og giftstoffer), som vanligvis kalles modifikatorer eller regulatorer enzymer. Under påvirkning av modifiseringsmidler på enzymet kan reaksjonen akselereres (aktivatorer) eller bremses ( hemmere).

Enzymaktivering bestemmes av akselerasjonen av biokjemiske reaksjoner som oppstår etter virkningen av modifikatoren. En gruppe aktivatorer består av stoffer som påvirker området til det aktive senteret til enzymet. Disse inkluderer enzymkofaktorer og substrater. Kofaktorer (metallioner og koenzymer) er ikke bare obligatoriske strukturelle elementer av komplekse enzymer, men i hovedsak deres aktivatorer.

Metallioner er ganske spesifikke aktivatorer. Noen enzymer krever ofte ioner av ikke ett, men flere metaller. For eksempel, for Na +, K + -ATPase, som transporterer monovalente kationer over cellemembranen, trengs magnesium-, natrium- og kaliumioner som aktivatorer.

Aktivering med metallioner skjer gjennom forskjellige mekanismer. I noen enzymer er de en del av det katalytiske stedet. I noen tilfeller letter metallioner bindingen av substratet til det aktive senteret av enzymet, og danner en slags bro. Ofte kombinerer metallet ikke med enzymet, men med substratet, og danner et metall-substratkompleks, som er å foretrekke for virkningen av enzymet.

Spesifisiteten til deltakelsen av koenzymer i binding og katalyse av underlaget forklarer deres aktivering av enzymatiske reaksjoner. Den aktiverende effekten av kofaktorer er spesielt merkbar når den virker på et enzym som ikke er mettet med kofaktorer.

Substratet er også en aktivator innenfor visse konsentrasjonsgrenser. Etter å ha nådd mettende konsentrasjoner av substratet, øker ikke enzymaktiviteten. Substratet øker stabiliteten til enzymet og letter dannelsen av den ønskede konformasjonen av det aktive senteret av enzymet.

Metallioner, koenzymer og deres forløpere og aktive analoger,

substrater kan i praksis brukes som enzymaktiverende legemidler.

Aktivering av noen enzymer kan utføres ved modifikasjoner som ikke påvirker det aktive senteret til molekylene deres. Det er flere alternativer for denne modifikasjonen:

1) aktivering av en inaktiv forgjenger - proenzym, eller zymogen. For eksempel omdannelsen av pepsinogen til pepsin ;

2) aktivering ved å feste en hvilken som helst spesifikk modifiserende gruppe til enzymmolekylet;

3) aktivering ved dissosiasjon av det inaktive proteinaktive enzymkomplekset.

2.5 Enzyminhibering

Det finnes reagenser som kan interagere mer eller mindre spesifikt med en eller annen sidekjede av proteiner, noe som fører til hemming av enzymaktivitet. Dette fenomenet gjør det mulig å studere naturen til aminosyresiderestene som er involvert i denne enzymatiske reaksjonen. I praksis må imidlertid mange finesser tas i betraktning, noe som gjør en entydig tolkning av resultatene oppnådd med spesifikke inhibitorer ganske vanskelig og ofte tvilsom. Først av alt, for at en reaksjon med en inhibitor skal være egnet for å studere arten av sidekjedene som er involvert i reaksjonen, må den tilfredsstille følgende kriterier:

) være spesifikk, dvs. inhibitoren må blokkere bare de ønskede gruppene;

) hemme enzymaktivitet, og denne inhiberingen bør bli fullstendig etter hvert som antallet modifiserte grupper øker;

) reagenset bør ikke forårsake uspesifikk denaturering av proteinet.

Det er 2 grupper av inhibitorer: reversible og irreversible. Inndelingen er basert på kriteriet om gjenoppretting av enzymaktivitet etter dialyse eller sterk fortynning av en enzymløsning med en inhibitor.

I henhold til virkningsmekanismen skilles konkurransedyktig, ikke-konkurrerende, ikke-konkurrerende, substrat- og allosterisk hemming.

Konkurransehemming

Konkurrerende hemming ble oppdaget ved å studere inhibering forårsaket av substratanaloger. Dette er inhibering av en enzymatisk reaksjon forårsaket av bindingen til det aktive senteret av enzymet av en inhibitor som i struktur ligner substratet og forhindrer dannelsen av et enzym-substratkompleks. Ved konkurrerende inhibering konkurrerer inhibitoren og substratet, som er like i struktur, om det aktive stedet til enzymet. Sammensetningen av molekyler som er større er assosiert med det aktive senteret.

Slike ideer om mekanismen for inhibering ble bekreftet av eksperimenter på kinetikken til konkurrerende hemmingsreaksjoner. Dermed ble det vist at i tilfelle av konkurrerende inhibering, påvirker ikke substratanalogen nedbrytningshastigheten til det allerede dannede enzym-substratkomplekset, dvs. ved bruk av et "uendelig stort" overskudd av substrat, oppnås samme maksimale hastighet både i nærvær og fravær av inhibitoren. Tvert imot påvirker inhibitoren verdien av dissosiasjonskonstanten og Michaelis-konstanten. Fra dette kan vi konkludere med at inhibitoren reagerer med proteingrupper som på en eller annen måte er involvert i å binde substratet, og på grunn av dets interaksjon med disse gruppene reduseres styrken av bindingen av substratet (dvs. antall enzymmolekyler). i stand til å binde underlaget reduseres).

Det ble senere vist at kinetisk konkurrerende inhibering ikke bare kan forårsakes av substratanaloger, men også av andre reagenser hvis kjemiske struktur er helt forskjellig fra strukturen til substratet. I disse tilfellene ble det også antatt at reagenset interagerer med gruppen som er ansvarlig for substratbinding.

For konkurrerende hemming eksisterer det teoretisk to muligheter:

1) de bindings- og katalytiske sentrene til enzymet overlapper hverandre; inhibitoren binder seg til dem, men påvirker bare gruppene i bindingssenteret;

2) bindingssenteret og det katalytiske senteret i enzymmolekylet er romlig adskilt; inhibitoren interagerer med bindingsstedet.

hvor I er en inhibitor, og KI er dissosiasjonskonstanten til enzym-inhibitorkomplekset.

Relativ hastighet (forholdet mellom hastigheten på en enzymatisk reaksjon målt i nærvær av en inhibitor (v i) , til maksimal hastighet) er lik

v i / V = ​​​​/ [E] T

siden for den totale enzymkonsentrasjonen er det sant

[E] T = [E] + +

deretter 1 / v i = (K s / V[S]) (1 + [I] / K I) + 1 / V

Selvfølgelig, hvis [I] = K I , da blir helningen på den rette linjen dobbelt så stor som for avhengigheten av 1/v 0 av [S] (v 0 er hastigheten på den enzymatiske reaksjonen i fravær av en inhibitor).

Typen hemming bestemmes vanligvis grafisk. Konkurrerende hemming gjenkjennes lettest ved å plotte Lineweaver-Burk-plott (dvs. plott i 1/v i-koordinater og 1/[S]) ved forskjellige inhibitorkonsentrasjoner. Med ekte konkurrerende inhibering oppnås et sett med rette linjer, som er forskjellige i tangens til helningsvinkelen og krysser ordinataksen (1/v i-aksen) på et tidspunkt. Ved enhver konsentrasjon av inhibitor er det mulig å bruke en så høy konsentrasjon av substrat at enzymaktiviteten vil være maksimal.

Et eksempel på konkurrerende hemming er effekten av ulike stoffer på aktiviteten til succinatdehydrogenase. Dette enzymet er en del av det sykliske enzymsystemet - Krebs-syklusen. Dets naturlige substrat er succinat, og en lignende konkurrerende hemmer er oksaloacetat, et mellomprodukt av samme Krebs-syklus:

En lignende konkurrerende hemmer av succinatdehydrogenase er malonsyre, som ofte brukes i biokjemiske studier.

Prinsippet om konkurransehemming er grunnlaget for virkningen av mange farmakologiske legemidler, plantevernmidler som brukes til å ødelegge landbruksskadedyr og kjemiske krigføringsmidler.

For eksempel er en gruppe antikolinesterase-medikamenter, som inkluderer derivater av kvaternære ammoniumbaser og organofosforforbindelser, konkurrerende inhibitorer av kolinesterase-enzymet i forhold til dets substrat acetylkolin. Kolinesterase katalyserer hydrolysen av acetylkolin, en mediator av kolinerge systemer (nevromuskulære synapser, parasympatisk system, etc.). Antikolinesterase-stoffer konkurrerer med acetylkolin om det aktive stedet for enzymet, binder seg til det og slår av den katalytiske aktiviteten til enzymet. Legemidler som prozerin, fysostigmin, sevin hemmer enzymet reversibelt, og organofosformedisiner som armin, nibufin, klorofos, soman virker irreversibelt, og fosforylerer den katalytiske gruppen til enzymet. Som et resultat av deres virkning akkumuleres acetylkolin i de synapsene der det er en mediator av nervøs eksitasjon, dvs. kroppen er forgiftet av akkumulert acetylkolin. Effekten av reversible inhibitorer avtar gradvis, siden jo mer acetylkolin akkumuleres, jo raskere fortrenger det inhibitoren fra det aktive senteret av kolinesterase. Toksisiteten til irreversible inhibitorer er uforlignelig høyere, så de brukes til å kontrollere landbruksskadedyr, husholdningsinsekter og gnagere (for eksempel klorofos) og som kjemiske krigføringsmidler (for eksempel sarin, soman, etc.).

Ikke-konkurrerende hemming

Ved ikke-konkurrerende hemming påvirker ikke den spesifikke inhibitoren dissosiasjonskonstanten til enzym-substratkomplekset. På den annen side er den maksimalt oppnåelige reaksjonshastigheten lavere i nærvær av en inhibitor enn i fravær, selv med et uendelig stort overskudd av substrat. Tilstedeværelsen av hemming beviser at inhibitoren binder seg til proteinet. Invariansen til dissosiasjonskonstanten både i nærvær og fravær av inhibitoren indikerer på sin side at, i motsetning til substratet, binder inhibitoren seg til en annen gruppe. Fra et teoretisk synspunkt kan mekanismen for slik hemming tolkes på ulike måter.

a) Bindingssenteret og det katalytiske senteret til enzymet er forskjellige. I dette tilfellet reduserer inhibitoren assosiert med det katalytiske senteret aktiviteten til enzymet og maksimalt oppnådd
hastighet uten å påvirke dannelsen av enzym-substratkomplekset.

b) Bindingssenteret og det katalytiske senteret overlapper med
overflaten av enzymet, og inhibitoren binder seg til andre grupper av proteinet. På grunn av bindingen av inhibitoren til overflaten av enzymet, endres proteininformasjonen og blir ugunstig for katalyse.

c) Inhibitoren binder seg ikke til verken det katalytiske stedet eller bindingsstedet, og påvirker ikke konformasjonen av proteinet. Imidlertid kan det lokalt endre ladningsfordelingen på en region av proteinoverflaten. Inhibering av aktivitet kan også oppstå i dette tilfellet hvis for eksempel ionisering av grupper som er essensielle for manifestasjonen av aktivitet blir umulig, eller hvis tvert imot ionisering av grupper som bare er aktive i ikke-ionisert form skjer. Dette fenomenet observeres hovedsakelig ved bruk av sterkt sure eller sterkt alkaliske reagenser.

Inhibitoren og substratet påvirker ikke hverandres binding til enzymet, men enzymkomplekser som inneholder inhibitoren er fullstendig inaktive. I dette tilfellet kan vi anta følgende elementære stadier:

v i / V = ​​​​/ [E] T

[E] T = [E] + + +

/ v i = (K s / V [S]) (1 + [I] / K I) + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Hvis [I] = K I, blir helningene til linjene og ordinaten til skjæringspunktet med den vertikale aksen doblet sammenlignet med 1/v 0.

Ikke-konkurrerende hemmere er for eksempel cyanider, som binder seg sterkt til jern(III)-jern, som er en del av det katalytiske stedet til hemin-enzymet - cytokromoksidase. Blokkering av dette enzymet slår av luftveiskjeden og cellen dør. Ikke-konkurrerende enzymhemmere inkluderer tungmetallioner og deres organiske forbindelser. Derfor er tungmetallioner av kvikksølv, bly, kadmium, arsen og andre svært giftige. De blokkerer for eksempel SH-grupper inkludert i enzymets katalytiske sete.

Ikke-konkurrerende hemmere er cyanider, som binder seg tett til jern(III)jern, som er en del av det katalytiske stedet for hemin-enzymet - cytokromoksidase. Blokkering av dette enzymet slår av luftveiskjeden og cellen dør. Det er umulig å fjerne effekten av en ikke-konkurrerende inhibitor med et overskudd av substrat (som effekten av en konkurrerende), men bare med stoffer som binder inhibitoren - reaktivatorer.

Ikke-konkurrerende inhibitorer brukes som farmakologiske midler, giftige stoffer for å kontrollere skadedyr i landbruket og til militære formål. I medisin brukes legemidler som inneholder kvikksølv, arsen og vismut, som ikke-konkurrerende hemmer enzymer i kroppens celler eller patogene bakterier, noe som bestemmer en eller annen av effektene deres. Under forgiftning er binding av giften eller dens fortrengning fra enzym-inhibitorkomplekset mulig ved hjelp av reaktivatorer. Disse inkluderer alle SH-holdige kompleksoner (cystein, dimerkaptopropanol), sitronsyre, etylendiamintetraeddiksyre, etc.

Ikke-konkurrerende hemming

Denne typen hemming kalles også konkurransehemmende i litteraturen. eller tilhørende hemming , Imidlertid er begrepet ikke-konkurrerende hemming den mest brukte. Det karakteristiske for denne typen hemming er at inhibitoren ikke er i stand til å binde seg til enzymet, men den binder seg til enzym-substratkomplekset.

I tilfelle av ikke-konkurrerende hemming, er komplekset som inneholder inhibitoren inaktivt:

v i / V = ​​​​/ [E]

[E] T = [E] + +

/ v i = K s / V[S] + (1 / V) (1 + [I] / K I)

Substrat hemming

Substratinhibering er hemming av en enzymatisk reaksjon forårsaket av et overskudd av substrat. Denne hemmingen skjer på grunn av dannelsen av et enzym-substratkompleks som ikke er i stand til å gjennomgå katalytiske transformasjoner.ES 2-komplekset er uproduktivt og gjør enzymmolekylet inaktivt. Substrathemming er forårsaket av et overskudd av substrat og lindres derfor når konsentrasjonen avtar.

Allosterisk hemming

Allosterisk regulering er kun karakteristisk for en spesiell gruppe enzymer med en kvartær struktur som har reguleringssentre for binding av allosteriske effektorer. Negative effektorer som hemmer omdannelsen av substrat i det aktive stedet til enzymet fungerer som allosteriske hemmere. Positive allosteriske effektorer, tvert imot, akselererer den enzymatiske reaksjonen og er derfor klassifisert som allosteriske aktivatorer. Allosteriske effektorer av enzymer er oftest forskjellige metabolitter, samt hormoner, metallioner og koenzymer. I sjeldne tilfeller utføres rollen som allosterisk effektor av enzymer av substratmolekyler.

Virkningsmekanismen til allosteriske inhibitorer på enzymet er å endre konformasjonen til det aktive senteret. En reduksjon i hastigheten på en enzymatisk reaksjon er enten en konsekvens av en økning i K m eller et resultat av en reduksjon i den maksimale hastigheten Vmax ved samme metningskonsentrasjoner av substratet, dvs. enzymet er delvis inaktivt.

Allosteriske enzymer skiller seg fra andre enzymer ved å ha en spesiell S-formet kurve for reaksjonshastighet kontra substratkonsentrasjon. Denne kurven ligner kurven for hemoglobin oksygenmetning; den indikerer at de aktive sentrene til underenhetene ikke fungerer autonomt, men samarbeidende, dvs. affiniteten til hvert påfølgende aktive senter for substratet bestemmes av graden av metning av de tidligere sentrene. Sentrenes koordinerte arbeid bestemmes av allosteriske effektorer.

Allosterisk regulering manifesterer seg i form av hemming av sluttproduktet til det første enzymet i kjeden. Strukturen til sluttproduktet etter en rekke transformasjoner av det opprinnelige stoffet (substratet) ligner ikke på substratet, derfor kan sluttproduktet kun virke på det initiale enzymet i kjeden som en allosterisk inhibitor (effektor). Eksternt ligner en slik regulering regulering ved hjelp av en tilbakemeldingsmekanisme og lar deg kontrollere utbyttet av sluttproduktet, i tilfelle akkumulering stopper arbeidet til det første enzymet i kjeden. For eksempel katalyserer aspartatkarbamoyltransferase (ACTase) den første av seks reaksjoner i syntesen av cytidintrifosfat (CTP). CTP er en allosterisk hemmer av AKTase. Derfor, når CTP akkumuleres, hemmes AKTase og videre CTP-syntese stopper. Allosterisk regulering av enzymer av hormoner har blitt oppdaget. For eksempel er østrogener en allosterisk hemmer av enzymet glutamatdehydrogenase, som katalyserer deamineringen av glutaminsyre.

Dermed inneholder selv den enkleste kinetiske ligningen for en enzymatisk reaksjon flere kinetiske parametere, som hver avhenger av temperaturen og miljøet der reaksjonen skjer.

Inhibitorer lar oss forstå ikke bare essensen av enzymatisk katalyse, men er også et unikt verktøy for å studere rollen til individuelle kjemiske reaksjoner som spesifikt kan slås av ved å bruke en hemmer av et gitt enzym.

3. Noen enheter som er praktiske for å bestemme innledende reaksjonshastigheter

Mange problemer med enzymatisk kinetikk fører til bestemmelsen av de innledende reaksjonshastighetene (v 0). Hovedfordelen med denne metoden er at verdiene av v 0 bestemt i det første øyeblikket vil gi den mest nøyaktige representasjonen av aktiviteten til enzymene som studeres, siden de akkumulerende reaksjonsproduktene ennå ikke har tid til å utøve en hemmende effekt på enzymet, og i tillegg er det reagerende systemet i en tilstand av stasjonær likevekt.

I laboratoriepraksis, men når man bruker konvensjonelle spektrofotometriske, titrimetriske eller andre teknikker for å registrere fremdriften av slike reaksjoner, går i beste fall opptil 15-20 tap fra den første tiden for å tilsette enzymet til substratet, blande det reagerende systemet, installere cellen osv. Og dette er uakseptabelt, siden tangenten i dette tilfellet bringes til punktet der tan ά 2< tg ά 1 . Не компенсируется потеря начального времени и при математической обработке таких кривых при записи выхода v 0 на максимальный уровень (V). Кроме того, протекание реакций без konstant blanding kompliseres ytterligere av fluktuasjoner i volumkonsentrasjonene av reagenser.

De enkle enhetene som er foreslått nedenfor for et spektrofotometer, pH-meter og lignende kan redusere kildene til de angitte feilene ved bestemmelse av v 0 betydelig.

3.1 Enhet for spektrofotometeret

Spektrofotometeranordningen består av en dispenser 1, en roterende teflonfilament 2 (rører) og et låselokk 3.

Dispenseren er en mikropipette, hvor den ene enden er formet med en nål 4, den andre med en utvidelse 5 (for å hindre at enzymet kommer inn i gummituppen 6).

I teflondekselet 3, som dekker spektralcellen 7, er det to hull: ett (8) i midten av dekselet, det andre (9) over midten av gapet mellom den ugjennomsiktige veggen til cellen 7 og lyset bjelke 10. Teflonrør 11 (innvendig diameter 1 -1,5 mm) den ene enden er festet i hull 9, den andre - på et fast fremspring 12 foran motorrotoren 13. Teflongjenger 2 settes inn i røret (gjengetykkelse 0,5) -0,6 mm). Den ene enden av gjengen er festet til den roterende rotoren til motoren 13, den andre - ført inn i kyvetten 7 - er formet i form av en spiral (for å forbedre blandingen). Plasseringen av tråden bestemmes av låsedekselet 3, uavhengig av fjerning av motoren, noe som er praktisk for arbeid som krever hyppige kyvetter.

Prinsipp for operasjon. Kvartskyvetten til spektrofotometeret 7 er fylt med substrat 14 (ca. 1,5-2,0 ml), satt inn i den termostatiske kyvetteholderen til spektrofotometeret, lukket med et lokk 3 med en roterende teflon-tråd 2, som er nedsenket i substratet 14, og alle videre operasjoner utføres i lysstrålen til spektrofotometeret og registreres på opptakeren.

I begynnelsen av arbeidet blandes underlaget, og opptakerpennen skriver en jevn horisontal (eller "null") linje. Dispenseren (med enzym) settes inn i hull 8 (nålen er nedsenket i substratløsningen 14), ved raskt å klemme tuppen 6, settes enzymet (vanligvis ca. 0,03-0,05 ml) inn i substratet, og dispenseren er fjernet. Blanding av komponentene avsluttes på 2,5-3 s, og registreringspennen registrerer begynnelsen av reaksjonen ved avviket til kurven for optisk tetthet (ΔA) mot tid.

Denne enheten gjør det også mulig å ta prøver fra det reagerende systemet for analyse; legge til inhibitorer og aktivatorer til systemet; endre reaksjonsbetingelser (endre pH, ionestyrke, etc.) uten å forstyrre registreringen av reaksjonsforløpet, noe som viser seg å være veldig praktisk, for eksempel når man studerer splitting n-NPF av "sure" fosfataser, hvor spaltning n-NFF utføres ved pH 5,0 (eller pH 6-7), og enzymaktivitet bestemmes av akkumuleringen n-nitrofenolat-ioner ved pH 9,5-10,0.

En slik enhet er også praktisk for å utføre spektrofotometrisk titrering av enzymer, etc.

3.2 Apparat for pH-måler

Innretningen for pH-måleren består av en modifisert spiss av strømningselektroden 1, en semi-mikrocelle 2, en dispenser 3 og en elektronisk krets for å koble pH-måleren til opptakeren. I tillegg inkluderer enheten en standard pH-meterelektrode (4), et celleholderdeksel (5), et termostatisk strømningskammer (6), en substratløsning (7), en passiv magnet (8) og en aktiv magnet ( 9).

Standardspissen på strømningselektroden til pH-måleren (LPU-01) erstattes med teflonrør 1 (innvendig diameter 1,3-1,5 mm) og fylles med asbesttråd, forbehandlet med en mettet KCl-løsning. Trådfyllingstettheten justeres slik at strømningshastigheten til KCl-løsningen gjennom røret er nær strømningshastigheten til den originale umodifiserte elektroden. Denne utskiftingen av spissen gjør det mulig å redusere størrelsen på den første arbeidscellen fra 20-25 til 2 ml, noe som gjør det mulig å bruke minimale volumer (1,5 ml) av løsninger av dyre biokjemiske legemidler.

Den elektroniske kretsen for å koble pH-måleren (LPU-01) til opptakeren består av en strømkilde (12 V DC-batteri), en vekslende ledningsmotstand R 1 (10 - 100 Ohm), som setter en spenning på 9 V på D809 zenerdiode i henhold til voltmeteravlesningen, en alternerende ledningsmotstand R 2 (15-150 Ohm), som regulerer innstillingen av "null" (referansepunktet) for pH-måleravlesningene på opptakerskalaen, og variabel ledningsmotstand R 3 (35-500 Ohm), som regulerer ekspansjonsskalaen (amplifikasjonen) av pH-skalaavlesningene - meter på opptakeren. Kretsen fungerer pålitelig til kildespenningen faller under 9 V.

Prinsipp for operasjon. 1,5 ml substrat tilsettes cellen (glassylinder 1,7x2,4 cm), og cellen festes på låselokket 5. Omrøring 9 slås på, og skriverpennen skriver en jevn (grunnleggende) referanselinje. Ved hjelp av en dispenser tilsettes 0,03 ml av enzymløsningen til substratet, og registreringspennen registrerer begynnelsen av reaksjonen ved avviket i pH-mot-tid (t)-kurven.

En slik enhet erstatter ikke en pH-stat, men med tanke på muligheten for å utvide pH-meterskalaen, lar den deg pålitelig registrere mindre endringer i pH på 0,004-0,005.

3.3 Nomogram-linjaler, praktisk for å bestemme starthastigheten

Betydelig kompleksitet ved å bestemme starthastigheten i tangentmetoden er beregningen av forholdet mellom endringer i konsentrasjonene av reagenser (Δ[S]) per tidsenhet (Δt), dvs. uttrykk v 0 i M/min fra betingelsene som

v 0 = lim Δ[S] / Δt, ved t 0.

I praksis består en slik prosedyre vanligvis av tre eller fire separate operasjoner: en tangent trekkes til den innledende delen av reaksjonsforløpskurven, deretter antall enheter av den registrerte verdien (optisk tetthet, rotasjonsvinkel, etc.) pr. et visst tidsintervall telles, og dette bringes til tidsenhet, og til slutt beregnes registreringsavlesningene på nytt for endringen i reagenskonsentrasjoner på 1 minutt (M/min). De foreslåtte to typene nomogramlinjal lar oss forenkle denne prosedyren.

Rektangulær linjal. v 0 er forholdet Δ[S]/Δt, dvs. tg ά, hvor ά er helningsvinkelen til tangenten til tidsaksen t. Den samme tangenten er også hypotenusen til den tilsvarende rettvinklet trekant med ben [S] og den. Jo større v 0, jo brattere helling på tangenten. Følgelig, hvis vi begrenser oss til et visst tidsintervall, for eksempel 1 minutt, vil vi få en rekke rette trekanter med forskjellige verdier av benet [S] (i virkeligheten forskjellige verdier av v 0). Hvis du kalibrerer begge ben: horisontalt - i tidsenheter (1 min) og vertikalt - i enheter for endring i reagenskonsentrasjoner, for eksempel i millimol (mM), og bruker de resulterende segmentene til et passende format laget av gjennomsiktig materiale (plexiglass) ca. 2 mm tykk), så kan du få en praktisk linjal for å bestemme de innledende reaksjonshastighetene. Alle tall og linjer brukes på baksiden av linjalen for å eliminere parallaksefeil ved bestemmelse av v 0 .

Prosedyren for å bestemme v 0 reduseres i dette tilfellet til to enkle operasjoner: en tangent trekkes til den innledende delen av den kinetiske kurven t 2 og kombiner nullpunktet til linjalens horisontale ben t med begynnelsen av tangenten, vil fortsettelsen av tangenten nå skjære konsentrasjonsskalaen [S] i punktet som bestemmer verdien v 0 i M/min (med horisontal posisjon av benet t på. Ingen ekstra operasjoner er nødvendig.

Bue linjal. Prosedyren for å bestemme v 0 kan forenkles til én operasjon hvis konsentrasjonsskalaen er plottet langs en bue med en viss radius.

En rett ("grunnleggende") linje 2 påføres en plate av gjennomsiktig materiale (alle tall og linjer er også påført på baksiden av linjalen) og fra nullpunktet (t=0, min) på denne linjen med en radius lik lengden på benet t=1 min [ , tegn en bue [S], fra topp til bunn, langs hvilken en skala av endringer i konsentrasjonene av reagenset (for eksempel substrat i mM) er plottet.

De beskrevne typene linjaler, en enhet for et spektrofotometer og en pH-meter har blitt brukt i en årrekke for å bestemme starthastighetene for reaksjoner (v 0), når man studerer substratspesifisiteten til enzymer, for spektrofotometrisk titrering, etc.

Konklusjon

Dette arbeidet undersøkte grenen av enzymologi som studerer avhengigheten av hastigheten på kjemiske reaksjoner katalysert av enzymer på en rekke miljøfaktorer. Grunnleggerne av denne vitenskapen regnes med rette som Michaelis og Menten, som publiserte sin teori om den generelle mekanismen enzymatiske reaksjoner, avledet de en ligning som har blitt det grunnleggende prinsippet for alle kinetiske studier av enzymer; den tjener som utgangspunkt for enhver kvantitativ beskrivelse av enzymers virkning. Den opprinnelige Michaelis-Menten-ligningen er en hyperbelligning; Lineweaver og Burke ga sitt bidrag til kinetikk, som transformerte Michaelis-Menten-ligningen og oppnådde en graf av en rett linje som verdien av V max kan bestemmes mest nøyaktig.

Over tid avtar endringen i hastigheten til en enzymatisk reaksjon i en enzymatisk reaksjon under eksperimentelle forhold. En reduksjon i hastighet kan oppstå på grunn av en rekke faktorer: en reduksjon i konsentrasjonen av substratet, en økning i konsentrasjonen av produktet, som kan ha en hemmende effekt, endringer i pH i løsningen, endringer i temperaturen av miljøet kan oppstå. Så for hver 10°C økning i temperatur, øker reaksjonshastigheten med 2 ganger eller enda mindre. Lav temperatur inaktiverer reversibelt enzymer. Avhengigheten av hastigheten til en enzymatisk reaksjon på pH indikerer tilstanden til de funksjonelle gruppene til det aktive senteret til enzymet. Hvert enzym reagerer forskjellig på endringer i pH. Kjemiske reaksjoner kan stoppes ved å virke på dem med ulike typer hemming. Den innledende reaksjonshastigheten kan bestemmes raskt og nøyaktig ved hjelp av enheter som nomogramlinjaler, en enhet for et spektrofotometer og en pH-meter. Dette gir den mest nøyaktige representasjonen av aktiviteten til enzymene som studeres.

Alt dette brukes aktivt i dag i medisinsk praksis.

Liste over kilder som er brukt

1. Belyasova N.A. Biokjemi og molekylærbiologi. - Mn.: bokhus, 2004. - 416 s., ill.

Keleti T. Grunnleggende om enzymatisk kinetikk: Trans. fra engelsk - M.: Mir, 1990. -350 s., ill.

3. Knorre D.G. Biologisk kjemi: Lærebok. for kjemi, biol. og honning spesialist. universiteter - 3. utgave, rev. - M.: Høyere. skole 2002. - 479 s.: ill.

4. Krupyanenko V.I. Vektormetode for å representere enzymatiske reaksjoner. - M.: Nauka, 1990. - 144 s.

5. Leninger A. Biokjemi. Molekylær basis for cellestruktur og funksjon: Trans. fra engelsk - M.: Mir, 1974.

6. Stroev E.A. Biologisk kjemi: Lærebok for legemidler. Institutt og farmak. fak. honning. Inst. - M.: Høyere skole, 1986. - 479 s., ill.

Severin E.S. Biokjemi. EN. - 5. utg. - M.: GEOTAR - Media, 2009. - 786 s., ill.